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質(zhì)粒提取的原理與常見(jiàn)問(wèn)題
發(fā)布者：莊盟生物發(fā)布時(shí)間：2015-03-09瀏覽次數：13559次
質(zhì)粒提取原理及常見(jiàn)問(wèn)題解析
質(zhì)粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區外能夠進(jìn)行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線(xiàn)粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸分子?，F在習慣上用來(lái)專(zhuān)指細菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線(xiàn)菌等生物中細胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱(chēng)為附加體(episome)，這類(lèi)質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細胞體內外都可復制。(Vector)(DNA)
目前，已發(fā)現有質(zhì)粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數的細菌質(zhì)粒都是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細菌染色體的0.5%～3%。根據相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類(lèi)：較大一類(lèi)的相對分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類(lèi)的相對分子質(zhì)量是10×106以下(少數質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細胞中的質(zhì)粒數主要決定于質(zhì)粒本身的復制特性。按照復制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類(lèi)：一類(lèi)是嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染色體復制一次時(shí)，質(zhì)粒也復制一次，每個(gè)細胞內只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類(lèi)是松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個(gè)細胞內一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個(gè)細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會(huì )使質(zhì)?？截悢翟鲋翈浊Х?。
質(zhì)粒提取原理
現在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（＞15Kb）。
堿裂解法是一種最廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠遠大于質(zhì)粒DNA，染色體DNA為線(xiàn)狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線(xiàn)性的大分子的染色體DNA完全變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調至中性后即可以恢復其天然構象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。
質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析
1、影響質(zhì)粒提取的因素有哪些？
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類(lèi)和培養條件、細菌細胞的裂解、質(zhì)?？截悢?、質(zhì)粒的穩定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。
2、為什么從革蘭氏陽(yáng)性菌中提取質(zhì)粒要在懸浮液中加入溶菌酶？
革蘭氏陽(yáng)性菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
3、如何根據實(shí)驗需要選擇不同級別的產(chǎn)品？
從純度上：各種常規操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化，普通純度的質(zhì)?？梢詽M(mǎn)足要求；而對于轉染實(shí)驗，則要求使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒方能滿(mǎn)足要求。
從提取的量上：1-20μg，應選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應選擇中量提取試劑盒；大于40μg，應選擇大量提取試劑盒。
從宿主菌上：分為普通細菌質(zhì)粒提取試劑盒、G+菌質(zhì)粒提取試劑盒和酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒，根據情況進(jìn)行選擇。
■ 未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低：
△ 大腸桿菌老化
請涂布平板培養后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養。
△ 質(zhì)?？截悢档?
由于使用低拷貝數載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體。
△ 菌體中無(wú)質(zhì)粒
有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經(jīng)多次轉接后有可能造成質(zhì)粒丟失。
例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(cháng)期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時(shí)應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
△ 堿裂解不充分
使用過(guò)多菌體培養液，會(huì )導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液1、2和3的用量。對低拷貝數質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液1、2和3，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。
△ 溶液使用不當
溶液2、3在溫度較低時(shí)可能出現渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
△ 吸附柱過(guò)載
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)?；蛩拗骶欠浅８叩目截悢祷蛏L(cháng)率，則需調整LB培養液體積。
△ 質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）
洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當加溫或延長(cháng)溶解時(shí)間。
△ 乙醇殘留
漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，樹(shù)脂型試劑盒漂洗后應晾干樹(shù)脂，再加入洗脫緩沖液。
△ 洗脫液加入位置不正確
洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì )完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。
△ 洗脫液不合適
DNA只在適當pH值的低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水；洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH 7.0–8.5間。當用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內，如果pH過(guò)低可能導致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使更用有利于提高洗脫效率。
△ 洗脫體積太小
洗脫體積對回收率有一定影響。隨著(zhù)洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
△ 洗脫時(shí)間過(guò)短
洗脫時(shí)間對回收率也會(huì )有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達到較好的效果。
■ 質(zhì)粒質(zhì)量不高：
△ 混有蛋白
不要使用過(guò)多菌體。溶液1、2、3處理并離心后溶液應為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。
△ 混有RNA
RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液3之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液1已保存6個(gè)月以上，請在溶液1中添加RNase A。
△ 混有基因組DNA
加入溶液2和3后應溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液2后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請減少菌體用量。細菌培養時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致細胞和DNA的降解，不要超過(guò)16小時(shí)。
△溶液3加入時(shí)間過(guò)長(cháng)
溶液3加入后，放置時(shí)間不要太長(cháng)，否則有可能會(huì )產(chǎn)生小片段DNA污染。
△ 含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。
△ 裂解時(shí)間過(guò)長(cháng)
加入溶液2后裂解時(shí)間不應超過(guò)5分鐘。
△ 質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式
質(zhì)粒復制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。
