1、蛋白樣品不能反復凍融；

2、蛋白樣品應加蛋白酶抑制劑，以增加蛋白的穩定性（建議最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑,具體細節請聯(lián)系本公司技術(shù)人員）；

3、細胞水平要做Western Blot，一般地5×10⁶個(gè)細胞提取的蛋白夠就足Western Blot；

4、如果目標蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，建議提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；

5、若轉膜不完全，可以加大上樣量，還有轉移時(shí)你可以用降低電流延長(cháng)時(shí)間，轉膜液中甲醇的比例多加5－10％；

6、如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì )有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb；

7、蛋白變性后，－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)；

8、脫脂奶粉中含生物素，如果實(shí)驗中有涉及到“生物素”請將封閉液改為BSA封閉；

9、做200kd以上蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉移時(shí)間需要相應延長(cháng)；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）；

10、蛋白的上樣量要根據實(shí)驗的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的Western Blot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超過(guò)0.3μg/mm2；

11、一抗，二抗的比例是比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底；12、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

解答：免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有些表位是線(xiàn)性的，而有的屬于構象型；線(xiàn)性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會(huì )消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個(gè)氨基酸，也就是線(xiàn)性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說(shuō)明書(shū)上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）；

13、抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融；

14、NC膜 PVDF膜 尼龍膜的差異。

尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類(lèi)型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價(jià)格最便宜；PVDF膜介于二者之間。

就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結合能力不強；PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。

就溫度適應性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線(xiàn)照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固；PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。

就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。

就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針?lè )肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。

15、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

16、膜、濾紙、膠大小有何講究？

解答：如果用的是半干法，順序為：陰極－濾紙－膠－膜－濾紙。濾紙的長(cháng)寬分別比膠面小1－2mm，而膜的長(cháng)寬分別比膠大1－2mm。絕對禁忌：上下兩層濾紙因為過(guò)大而相互接觸，這樣會(huì )短路，電流不會(huì )通過(guò)膠和濾紙。

17、電泳時(shí)Marker總跑不全所有條帶，即使用增大膠濃度仍不全？

檢查兩種緩沖液Tris-HCl（pH 8.8和 pH 6.8），有可能有長(cháng)菌現現象，建議重配兩種緩沖液。

18、Western Blot染色的選擇

（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統的甲醇會(huì )引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。

（2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色不穩定。

（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。

19、轉膜液加甲醇的目的是什么？

加甲醇起著(zhù)一定的固定作用，因為小分子蛋白質(zhì)容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質(zhì)的能力較弱)。

20、轉膜時(shí)何為濕法，何為半干法？

半干法和濕法轉移是兩種不同的轉移裝置下的轉移系統，將膜，膠，濾紙整個(gè)浸泡在buffer的Tank里轉移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來(lái)做轉移體系的叫半干法。

21、為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致？同樣的電壓可以嗎？

濃縮膠的目的使得loading 的樣品能夠在同一條水平線(xiàn)上進(jìn)入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來(lái)前進(jìn)入分離膠。而在分離的理論上（實(shí)際上也是）小電壓長(cháng)時(shí)間分離的效果會(huì )更好，但是在操作過(guò)程中沒(méi)有必要等那么長(cháng)的時(shí)間，所以就用大電壓快點(diǎn)跑。