克隆、轉化相關(guān)問(wèn)題
為使亞克隆實(shí)驗成功，并能在未獲得目的克隆時(shí)，查明實(shí)驗失敗的原因，每次實(shí)驗應包括相應的對照。其中包括：
感受態(tài)細胞的轉化效率
抗菌素是否有效
連接的效率
未連接質(zhì)粒的背景
磷酸酶處理的效果
轉化效率1×106 cfu/mgDNA可滿(mǎn)足普通的亞克隆實(shí)驗；1×107 cfu/mgDNA用于作更復雜的亞克隆，有限量的DNA的轉化，T-克隆實(shí)驗；構建文庫和突變要求用的轉化的效率為>1×108 cfu/mgDNA。
4、 使用pGEM載體克隆大片段時(shí)（＞7-8Kb），轉化時(shí)菌株在30℃而不是37℃生長(cháng)，更有利于細胞的復蘇。
為檢測連接反應的效果，線(xiàn)化（單限制性酶切，非磷酸酶處理）質(zhì)粒需同實(shí)驗樣品平行連接。取一部分連接反應液用于轉化，隨后涂布到選擇培養基上。平板上所生長(cháng)的菌落數，可同相同量、未連接的線(xiàn)化質(zhì)粒、轉化相同數目的細菌后，涂布在選擇培養基上所生長(cháng)的菌落數比較。如果連接成功，自連接質(zhì)粒在平板上的菌落數，會(huì )遠遠高于未連接的線(xiàn)化質(zhì)粒轉化細菌所得的菌落數。如果線(xiàn)化成功，未連接的線(xiàn)化質(zhì)粒（未連接的質(zhì)粒背景）所得的菌落數應很低。如連接效率高，則自連質(zhì)粒所得的菌落數應同用完整質(zhì)粒轉化細菌所得的菌落數相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質(zhì)粒和連接質(zhì)粒在瓊脂上電泳，連接后的樣品的遷移率會(huì )降低。
1．確認Insert DNA片段的3＇末端是否帶有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等）擴增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，不能直接進(jìn)行TA克隆。
2．純化PCR產(chǎn)物。最好使用切膠回收的PCR片段，以除去PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。進(jìn)行切膠回收時(shí)可以使用莊盟是生物的小量瓊脂糖凝膠回收試劑盒（ZP202）。
3．請使用轉化效率大于108cfu/μg pUC19 DNA的感受態(tài)細胞。
4．DNA片段的立體結構、DNA片段的長(cháng)短都會(huì )影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉化效率）偏低，此時(shí)可以延長(cháng)連接反應時(shí)間，或采用電轉化方法。
5．進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)，不要使DNA片段在紫外線(xiàn)下暴露時(shí)間過(guò)長(cháng)。
6．建議使用新配制的平板培養基。
陽(yáng)性克隆鑒定方法有哪些?
1．藍白斑篩選。
藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法，一般情況下，β-半乳糖苷酶的表達將受到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養時(shí)將顯示白色菌落。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的讀碼框相吻合，克隆體也會(huì )顯示藍色菌落。有報道稱(chēng)，2 kbp的DNA片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍色。所以，當我們沒(méi)有得到白色菌落時(shí)，可以試著(zhù)檢測藍色菌落。
2．菌落PCR方法。
以變性后的菌液為模板，使用載體通用引物進(jìn)行PCR擴增鑒定。
使用滅菌后的牙簽挑取白色菌落，在預備好的ddH2O（10μl）中蘸洗，99℃，10 min變性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer， Taq等）。
94℃ 1 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 30 Cycles
72℃ 1 kbp/min
說(shuō)明： a．所用引物通常為載體通用引物。
以提純后的質(zhì)粒DNA為模板，使用PCR擴增引物進(jìn)行PCR擴增鑒定。
94℃ 1 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 30 Cycles
72℃ 1 kbp/min
說(shuō)明：擴增產(chǎn)物的大小就是PCR產(chǎn)物的大小。
利用載體多克隆位點(diǎn)上限制酶或者PCR引物導入酶切位點(diǎn)的限制酶，對提純后的質(zhì)粒DNA進(jìn) 行雙酶切鑒定。 說(shuō)明：雙酶切后，電泳顯示兩條帶，分別為載體大小和PCR產(chǎn)物的大小。
1 問(wèn)題：做轉化時(shí)，用藍白斑篩選，以獲得陽(yáng)性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用藍白斑篩選，有什么區別嗎？藍白斑篩選有什么作用嗎？
對于這一問(wèn)題，我想，抗性篩選是防止雜菌生長(cháng)。理論上說(shuō)，當培養基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖。藍白篩選是驗證是否有插入片斷。兩者結合起來(lái)，更有利于篩選到我們的目的菌。
2 問(wèn)題：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，長(cháng)出來(lái)的白斑一定都是含有插入片段的嗎？有沒(méi)有可能是載體自連的？
答：可以說(shuō)，世界上沒(méi)有絕對的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，長(cháng)出來(lái)的白斑也不一定都是含有插入片段的陽(yáng)性克隆，具體原因可能有：
1）有可能是載體自連的假陽(yáng)性；
2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒(méi)涂均勻。
3）有時(shí)即使插入片段也會(huì )出現籃斑。只要編碼框沒(méi)被破壞。
3 問(wèn)題：如何篩選重組菌落?
答：可使用藍/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉入重組質(zhì)粒的菌株為藍色。
4 問(wèn)題：藍白斑篩選如何篩選合適的宿主菌株?
答：如進(jìn)行藍/白斑篩選，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區應在染色體或附加體上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于藍/白斑篩選。
5 問(wèn)題：在藍白斑篩選的過(guò)程中沒(méi)有藍斑是什么原因導致的？因為通過(guò)PCR檢測插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并沒(méi)有插入片段。
答：原因很多，
1）可能是你用的培養基含有乳糖或葡萄糖，因為半乳糖甘酶會(huì )分解乳糖，導致不能與X-Gal反應，葡萄糖不會(huì )誘導融合基因的表達。
2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒(méi)涂均勻。
3）很多因素會(huì )造成PCR失敗。
6 問(wèn)題：我最近轉化大腸桿菌時(shí)，通過(guò)藍白斑篩選，挑出白色菌落做PCR，可是在電泳時(shí)發(fā)現在有目的帶的同時(shí)還有比目的帶小的雜帶，不知為什么？我反復篩了幾次，都是這樣，可不可以搖菌提質(zhì)粒？我應該下一步怎么做？
答：針對這樣的情況，我覺(jué)得，你首先做酶切鑒定，看看你的目的片段是否真正插入。其次，你應該檢測PCR過(guò)程有沒(méi)有問(wèn)題。
7 問(wèn)題：我用Amp-IPTG-X-gal LB平板進(jìn)行藍白斑篩選重組子，為何篩出的全是白斑，沒(méi)一個(gè)藍斑，挑幾個(gè)白斑搖菌擴增后PCR檢測也全是陽(yáng)性克隆，不會(huì )全都重組成功了吧？什么原因呢？
答：這樣的情況是完全有可能的，只要載體處理的好，應該說(shuō)是有這種可能。
藍白斑篩選是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等?，F在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質(zhì)粒之間實(shí)現了互補，稱(chēng)為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導致無(wú)α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱(chēng)為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。
IPTG 與X-Gal介紹
IPTG即Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也稱(chēng)Isopropyl β-D-thiogalactoside，中文名為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。分子式為C9H18O5S ，分子量為238.30，CAS Number 367-93-1，Ultra Pure，dioxane free，常用于藍白斑篩選，如果在平板培養基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互補性，可以根據是否呈現白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組體。此外，它還可以作為具有lac或tac等啟動(dòng)子的表達載體的表達誘導物使用。
IPTG 與X-Gal配置
IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）的水溶液，并進(jìn)行過(guò)濾除菌后保存。
X-gal用二基甲酰胺DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應貯存于-20℃。X-gal溶液無(wú)須過(guò)濾除菌。
使用方法：
在100 ml的瓊脂培養基中，當培養基溫度為55℃左右時(shí)，加入100 μl的24 mg/ml（100 mM）IPTG、200 μl的X-Gal（20 mg/ml）和100 μl的Amp（100 mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養基。
