基因組DNA提取原理及常見(jiàn)問(wèn)題分析
基因組,Genome,一般的定義是單倍體細胞中的全套染色體為一個(gè)基因組,或是單倍體細胞中的全部基因為一個(gè)基因組?,F代遺傳學(xué)家認為,基因是DNA(脫氧核糖核酸)分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱(chēng),是具有遺傳效應的DNA分子片段?;蛭挥谌旧w上,并在染色體上呈線(xiàn)性排列?;虿粌H可以通過(guò)復制把遺傳信息傳遞給下一代,還可以使遺傳信息得到表達。不同人種之間頭發(fā)、膚色、眼睛、鼻子等不同,是基因差異所致。
利用基因,人們可以改良果蔬品種,提高農作物的品質(zhì),更多的轉基因植物和動(dòng)物、食品將問(wèn)世,人類(lèi)可能在新世紀里培育出超級物作。通過(guò)控制人體的生化特性,人類(lèi)將能夠恢復或修復人體細胞和器官的功能,甚至改變人類(lèi)的進(jìn)化過(guò)程。
本公司根據不同樣品來(lái)源(如:細菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、動(dòng)物細胞、植物組織、植物細胞等),制作了多種提取得率高,純度好,簡(jiǎn)單方便的試劑盒。
產(chǎn)品特點(diǎn)
整個(gè)實(shí)驗流程不需要昂貴儀器,不需使用酚氯仿等有毒試劑,能夠得到高純度的大片段基因組DNA,操作簡(jiǎn)單,可同時(shí)處理多個(gè)樣品。
提取得到的基因組DNA可用于各種方向的分子生物學(xué)實(shí)驗,如:文庫構建、基因圖譜、Sunthern-Blotting、PCR等。
使用樣品
細菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、動(dòng)物細胞、植物組織、植物細胞等,最好使用新鮮樣品,或取樣后迅速將樣品密封,放于-20℃或-70℃保存,注意避免多次凍融樣品,否則將會(huì )導致所得基因組DNA的片段變小且提取質(zhì)量下降。
基因組DNA提取過(guò)程中注意事項:
1、因為DNA的一級結構是分子生物研究的基礎,所以應盡量保證DNA的完整性。
2、盡量去除多余雜質(zhì),如:蛋白、脂類(lèi)、多糖、有機溶劑等的污染,以確保下游實(shí)驗的順利進(jìn)行。
樣品的預處理方式
植物材料:液氮研磨
動(dòng)物材料:勻漿、液氮研磨
細菌:溶菌酶破壁
酵母:破壁酶,玻璃珠研磨
基因組提取常見(jiàn)問(wèn)題
◆ 洗滌后硅膠膜上仍有雜質(zhì)殘留:
細胞裂解不充分, 裂解液和樣品要快速充分混勻。
◆ 柱子堵塞:
1.裂解或勻漿處理不徹底。減少樣品使用量,增加裂解液用量,增加勻漿和裂解時(shí)間。
2.處理樣品太多。
◆ 洗脫產(chǎn)物DNA量很少或沒(méi)有:
1.樣品中細胞或病毒濃度低。
2.裂解液和樣品混合不均勻造成的細胞裂解不充分。
3.蛋白酶K活性下降造成的細胞裂解不充分。
4.溫浴時(shí)間不夠造成的細胞裂解不充分或蛋白降解不完全,盡量把組織切成小塊,延長(cháng)溫浴時(shí)間,使裂解物中沒(méi)有顆粒狀物質(zhì)殘留。
5.在上柱前,裂解物中沒(méi)加乙醇,或用低濃度乙醇代替無(wú)水乙醇。
6.DNA沒(méi)有有效洗脫。提高洗脫效率,可將離心吸附柱加入洗脫液后在室溫靜置至少1 min,再離心。
7.洗脫液pH不合適,低pH值會(huì )減少DNA產(chǎn)率。確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間。
8.洗脫體積太大,超過(guò)200μl洗脫體積所得的DNA濃度會(huì )降低,但DNA總量不會(huì )減少。
◆ A260/A280 比值較低:
用水作為洗脫液時(shí),比值偏低。
◆ A260/A280 比值較高:
大量RNA殘留,沒(méi)有使用RNase A,或RNase A活性下降。
◆ DNA影響后續酶反應實(shí)驗:
1.在洗脫液中有殘留的漂洗液W1,可通過(guò)再次離心去除硅膠膜上的W1。
2.大量RNA殘留。
◆ 緩沖液A、B中有白色沉淀:
白色沉淀可能由于低溫或長(cháng)時(shí)間放置產(chǎn)生,可在使用前在56℃重新加熱溶解。
◆ 操作中加入緩沖液B有白色沉淀:
緩沖液B加入后產(chǎn)生的白色沉淀在70℃溫浴時(shí)會(huì )消失,不會(huì )影響下游操作。