PCR反應組分

引 物

引物與模板配對的長(cháng)度應至少為17個(gè)核苷酸，最高不宜超過(guò)30個(gè)核苷酸，最佳長(cháng)度為20-24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應在酶切位點(diǎn)5＇端多加幾個(gè)堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量組成應均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體；兩個(gè)引物中（G+C）%含量應盡量相似；引物內部應避免形成明顯的二級結構，如發(fā)夾結構；兩個(gè)引物之間不應發(fā)生互補；特別是在引物3＇端最好有富有GC，這樣退火后有利于3＇端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)過(guò)色譜層析或PAGE純化，以除去未能合成至全長(cháng)的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右，濃度太高會(huì )導致非特異性擴增，太低則擴增產(chǎn)物太少。

模 板

模板可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線(xiàn)狀DNA。模板量一般不需太多，不超過(guò)1μg為宜，因為模板量過(guò)多可能導致非特異性擴增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如：使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當加大模板用量。

反應緩沖液

緩沖液的PH值，鹽離子濃度、助溶劑成分等都會(huì )對PCR反應產(chǎn)生影響。我公司提供的Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM，可以適用于大多數PCR反應，但它并非對任何模板和引物的組合都是最佳的。

酶  量

50μl反應體系可用0.5-5U酶，酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關(guān)，酶量過(guò)多易發(fā)生非特異性反應，而且可能增加突變的機率，尤其在進(jìn)行高保真擴增時(shí)，應盡量減少酶量，但酶量過(guò)少時(shí)反應性能會(huì )下降。

PCR反應條件

變性溫度與時(shí)間

模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會(huì )產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì )啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì )很快復性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì )影響酶的活性，一般情況下可設為94℃ 20-30秒，高溫時(shí)間應盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，最高變性溫度不宜超過(guò)95℃。

退火溫度與實(shí)踐

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設置特定反應的最適退火溫度，可根據引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測，一般實(shí)驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30-60秒，足以使引物與模板之間結合，沒(méi)有必要長(cháng)時(shí)間退火。

延伸溫度與時(shí)間

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間，延伸時(shí)間根據所有聚合酶擴增速度和擴增片段大小設定。如同樣擴增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分鐘，使用Pfu酶則應設定2分鐘以上。延伸時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致非特異性擴增帶的出現。時(shí)間太短則可能得不到擴增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

循環(huán)次數

可根據模板DNA的量，擴增片段的大小和擴增產(chǎn)物的下步應用等因素，設定30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數太少，擴增量不足，如果循環(huán)次數太多，錯配幾率會(huì )增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數。