■ 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品利用高效重組酶和同源重組原理，只需DNA插入片段末端與載體末端具有15-20個(gè)同源堿基序列，就可以在載體的任意位點(diǎn)完成目的片段與載體的克隆重組。本產(chǎn)品可實(shí)現1-4個(gè)片段的高效無(wú)縫拼接；采用非連接酶克隆體系，可極大地降低載體的自連，保證產(chǎn)品克隆陽(yáng)性率在90%以上。
■ 產(chǎn)品特點(diǎn)
1. 靈活的克隆位點(diǎn)：任何載體的任意位置。
2. 快速簡(jiǎn)便：30分鐘完成載體構建。
3. 精確：不會(huì )增加任何額外的程序。
4. 效率高：高達90%陽(yáng)性克隆率。
■ 無(wú)縫克隆流程圖
■ 常見(jiàn)問(wèn)答
1、“同源序列”指的是特殊序列嗎？
答：無(wú)縫克隆要求的同源序列不是某個(gè)特殊序列，簡(jiǎn)單講同源序列可以直接理解為“相同序列”，即DNA片段的連接處有15-20個(gè)相同的序列。
2、最佳克隆位點(diǎn)選擇？
答：在選擇克隆位點(diǎn)時(shí)，應避免選擇上下游50bp內有重復序列的區域。當克隆位點(diǎn)上下游25bp區域內GC含量均在40%-60%范圍內時(shí)，重組效率將達到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會(huì )受到較大影響。
3、同源序列的長(cháng)度與退火溫度計算？
答：同源序列長(cháng)度推薦15-20bp。實(shí)驗結果顯示，低于15bp（如10bp），轉化率明顯下降；大于20bp（如30-40bp），轉化效率差異不大，考慮成本，不推薦20bp以上。
計算擴增引物退火溫度時(shí)，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
4、無(wú)縫克隆插入片段的最短長(cháng)度？
答：建議插入片段≥100bp。
5、PCR擴增產(chǎn)物帶A尾（或者其他尾）是否影響無(wú)縫克??？
答：任何PCR酶擴增產(chǎn)物都可以用于無(wú)縫克隆，無(wú)需考慮產(chǎn)物末端有無(wú)A尾 (重組過(guò)程中將被去除，在最終載體中不會(huì )出現)。但為了減少擴增突變或者產(chǎn)物要求高保真時(shí)，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴增。
6、 酶切產(chǎn)物做無(wú)縫克隆是否要做去磷酸化處理？
答：不需要。
7、PCR產(chǎn)物做無(wú)縫克隆是否要切膠純化？
答：PCR產(chǎn)物同時(shí)滿(mǎn)足以下條件時(shí)，產(chǎn)物純化即可，不必切膠純化：
A、PCR模板不為質(zhì)?；蛘哔|(zhì)?？剐圆煌谀繕溯d體；
B、無(wú)明顯雜帶且主帶占95%以上。
8、無(wú)縫克隆長(cháng)斑數較少？
答：主要可能有以下幾種情況：
1）引物設計不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點(diǎn)+基因特異性擴增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受態(tài)細胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細胞，確保其轉化效率>107 cfu/μg。每次操作時(shí)可設置一組轉化質(zhì)粒的對照實(shí)驗，以檢測感受態(tài)細胞的轉化效率。選擇克隆感受態(tài)細胞(如DH5α)，不能選擇表達感受態(tài)細胞。
3）線(xiàn)性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物的使用量不足/過(guò)量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應體系。
4）線(xiàn)性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物不純，抑制反應：線(xiàn)性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應不超過(guò)反應體系體積的1/5，如10μL體系不超過(guò)2μL。建議線(xiàn)性化載體、插入片段擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。
9、出現較多假陽(yáng)性？
答：主要有以下幾種可能情況：
1）載體線(xiàn)性化不完全：即使是痕量未完全酶切的載體也會(huì )產(chǎn)生很高的轉化背景?？赏ㄟ^(guò)陰性對照檢測載體是否線(xiàn)性化完全，優(yōu)化酶切體系，提高限制性?xún)惹忻甘褂昧?、延長(cháng)酶切反應時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。
2）插入片段擴增產(chǎn)物混有非特異擴增產(chǎn)物。建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。
3）反應體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，若擴增產(chǎn)物直接用于重組反應，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會(huì )產(chǎn)生較高的轉化背景。建議擴增產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化或擴增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。
10、菌落PCR無(wú)條帶？
答：主要有以下可能情況：
1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測。
2）PCR體系或程序不合適：沒(méi)有目的條帶也沒(méi)有空質(zhì)粒條帶。建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗證；或者進(jìn)行酶切驗證。
3）重組失?。簺](méi)有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶。說(shuō)明重組不成功，載體線(xiàn)性化不完全，建議優(yōu)化酶切體系。
