金擔子素A(Aureobasidin A,AbA)是從絲狀真菌 Aureobasidium pullulans No. R106 中分離出來(lái)的環(huán)酯肽類(lèi)抗生素,具有很強的抗真菌能力。AbA 作用機制是抑制酵母中 AUR1 基因(1,2)編碼的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干擾鞘脂合成,從而殺死菌株。AbA在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/mL)即可對酵母產(chǎn)生毒性。編碼IPC合成酶的基因研究較多的來(lái)自釀酒酵母菌的AUR1基因,以及構巢曲霉的AURA基因,兩者具有同源性。通過(guò)對編碼 AUR1-C基因進(jìn)行突變即可使得菌株對AbA產(chǎn)生抗性,作為蛋白質(zhì)互作研究的報告基因。
因為AbA可以直接殺死敏感的酵母菌株,而不是延遲菌株生長(cháng),所以AbA篩選有利于陽(yáng)性克隆的生長(cháng)和識別。與營(yíng)養報告基因(如 HIS3)進(jìn)行低嚴緊度初篩相比,AbA篩選大大消除了背景克隆。實(shí)際操作中,用AbA進(jìn)行初篩時(shí)會(huì )獲得更多克隆,之后再用 4 個(gè)報告子(AUR1-C,HIS3, ADE2 和 MEL1)進(jìn)行高嚴緊度的二次篩選以驗證陽(yáng)性克隆。AbA非常適合用作陽(yáng)性克隆子篩選用的藥物選擇性標記;也是酵母單/雙雜交研究中理想的報告子,可以簡(jiǎn)化酵母雙雜交文庫篩選。MEL1和lacZ分別編碼 a-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶,可以作用于相應的底物X-a-Gal和X-Gal使酵母變藍。其中,a-半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接檢測到;β-半乳糖苷酶是內分泌酶,需要將酵母破碎后才能檢測到。用藍斑顯示酵母細胞內兩個(gè)蛋白的相互作用的方法不僅具有較高的敏感性,而且藍斑的深淺還可以反映兩個(gè)蛋白相互作用的強弱。